泛亚电竞在生物医疗领域的应用越来越广泛，以下是我们在肠道固有层免疫细胞分离实验中所需的准备和操作步骤，希望能够为相关研究提供参考。

实验准备

试剂准备
40% Percoll溶液的制备：将Percoll细胞分离液和PBS缓冲液（10×）以9:1的体积比混合，形成等渗的100% Percoll母液。接着将100% Percoll母液与RPMI1640/1×PBS以4:6的体积比混合，制成40%等渗Percoll溶液。

80% Percoll溶液的制备：同样将Percoll细胞分离液与PBS缓冲液（10×）以9:1的体积比混合，配制成等渗100% Percoll母液。然后将100% Percoll母液与RPMI1640/1×PBS以8:2的比例混合，形成80%等渗Percoll溶液。

肠道固有层免疫细胞分离步骤

1. 使用颈椎脱臼法处死小鼠，并将其固定在手术台上，用75%酒精消毒小鼠腹部，沿中线纵向切开，暴露腹腔。

2. 在小鼠胃与十二指肠连接处剪断，分离小肠周围脂肪组织和肠系膜，同时拉出小肠，然后在小肠和盲肠连接处剪断，从而将小肠单独分离出来。

3. 将小肠放入含有5mL预冷PBS的10cm培养皿中洗涤，使用镊子和剪刀去除脂肪组织及派伊尔结。

4. 将小肠切成四段并纵向剪开，轻轻刮除肠内容物。

5. 将小肠转移至含10mL HBSS+2% FBS的50mL离心管中，剧烈涡旋10-20秒。

6. 用镊子取出小肠并重复清洗两次。

7. 将清洗后的肠组织切成约0.5cm的小块，转移到2mL圆底管中，加入1mL小鼠肠道组织解离液，在37°C的摇床上轻轻摇动孵育60分钟（可根据组织糜烂情况适当延长时间）。

8. 结束孵育后，将圆底管取出，剧烈涡旋10-20秒，通过70μm细胞筛网过滤，利用10mL PBS冲洗细胞筛网。

9. 将含有细胞的滤液收集至50mL管中，进行400g离心5分钟，弃去上清液。

10. 用4mL 40% Percoll重悬细胞沉淀，并转移至15mL离心管中。随后，吸取25mL 80% Percoll，于管底部加入，使其形成密度梯度。

11. 以800g的速度离心20分钟，注意控制加速和减速速率。

12. 离心结束后，将中间白膜层的免疫细胞转移至新的15mL离心管中，加入3倍体积的4°C PBS，颠倒混匀后进行400g离心5分钟，弃去上清。

13. 按照步骤12重复清洗一次，最终获得肠道固有层淋巴细胞。

14. 将细胞染色缓冲液重悬细胞沉淀，并调整细胞浓度至5-10×10^6 cells/mL，将100μL/管的细胞悬液分配至12×75mm的流式管中，以备后续实验使用。

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• 流式管（无菌无酶，带盖）：500个
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